我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，伴隨著農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)加工，每 年產(chǎn)生大量農(nóng)業(yè)廢棄物。 這些農(nóng)業(yè)廢棄物資源再 生利用率極低，大部分被浪費(fèi)。 大力開發(fā)利用這 些資源可以緩解環(huán)境、資源和糧食危機(jī)，因此農(nóng)業(yè) 廢棄物再利用成為近十幾年各國(guó)研究的熱點(diǎn)。 木 聚糖是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的半纖維素， 為世界第二大 可再生資源。 由于木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它的徹底水 解需要一系列酶的協(xié)同作用， 其中最關(guān)鍵的酶是 木聚糖酶。 在眾多應(yīng)用中，以木聚糖經(jīng)酶法制取 有較高附加值的功能低聚糖， 是富含半纖維素材 料的農(nóng)業(yè)廢棄物再生利用的有效增值途徑， 具有 巨大的潛在經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品來自云南、貴州、河南、河北等 15 個(gè) 地區(qū)。 樣品采用鐵鏟采集，用刮刀除去 5 cm 厚的 表層土。 將采集的土壤樣品保存于無菌塑料袋中， 于-4 ℃冰箱保存待用。

1.2 主要試劑

DNA 瓊脂糖凝膠回收 試劑盒 （ 美 國(guó) OMEGA）；瓊脂糖（西班牙 Biowest）；十六烷基三甲 基溴化銨（CTAB）、十二烷基磺酸鈉（SDS）購自上 海生工生物技術(shù)有限公司；RNA 酶， 蛋白酶 K 來 自 （日本 TAKARA）；Sau 3A I、BamH I、CIAP、T4 DNA 連 接 酶 、Q5 DNA 聚 合 酶 、λDNA/Hind III、 DL2000、1 kb Plus DNA Ladder，pUC19、E.coli DH5、pET28a 載 體 、E.coli BL21 （DE3）感 受 態(tài) 細(xì) 胞 （日本 TAKARA）； 氨芐霉素 （Amp） 蛋白 胨 （Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）（英國(guó) Oxford 公司）；Gel Exraction Kit （美國(guó) OMEGA）；剛 果 紅，卡 那 霉 素（美 國(guó) AMRESCO）；櫸 木 木 聚 糖 （美國(guó) Sigma）。

1.3 主要設(shè)備與儀器

DYC P-31BN 水 平 電 泳 槽 、DYY-10C 電 泳 儀， 北京六一儀器廠；Image Quant 300 凝膠成像儀、Multitemp III 恒溫循環(huán)水浴器， 美國(guó) GE 公 司；Sigma 1-14 小型臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó) Sigma 公司；WD-9405B 型水平搖床，北京六一；PCR 儀， Biometra，德國(guó)；ImageQuant 300 凝膠成像儀，Multitemp III 恒溫循環(huán)水浴器，美國(guó) GE；瓊脂糖凝膠 電泳儀，北京六一；DHZ-DA 全溫振蕩器，江蘇太 倉培英；萬向搖床TS-92型,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Nanodrop 核酸定量?jī)x，Thermo 公司。

1.4 土壤宏基因組文庫構(gòu)建

每次稱取 80 g 土壤， 用提取緩沖液 （TrisHCl：100 mmol/L pH 8.0； EDTA：100 mmol/L， pH 8.0；NaCl：1.5 mol/L；CTAB：1%） 溶 解 稀 釋 土 樣 ， 225 r/min。 混勻 2～3 h。 具體提取方法參照 Zhou 等 1。 將回收后的 DNA 片段采用 Sau3A I 進(jìn)行部分 酶切，并與經(jīng) BamH I 酶切后與 pUC19 載體進(jìn)行 連接，電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到 DH5α 中。

1.5 土壤宏基因組文庫的篩選

土壤宏基因組文庫的篩選方法參照 Kwon 等， 將文庫中的克隆子轉(zhuǎn)接到含有 0.5%的木聚 糖底物的平板上培養(yǎng) 24 h，將平板放置在 50 ℃烘 箱 30 min 后，剛果紅染色 15 min， 1 mol/L 的 NaCl 脫色 15 min， 在底物平板上能產(chǎn)生透明圈的克 隆即為陽性克隆。

1.6 木聚糖酶基因

cbxynA 序列分析 對(duì)上述篩選得到的陽性克隆子提取質(zhì)粒并測(cè) 序， 用在線軟件預(yù)測(cè)外源插入片段所有可能的開 放閱讀框，用 DNAMAN 預(yù)測(cè)目的基因可能的分子 質(zhì)量和等電點(diǎn)。

1.7 重組酶

CBXYNA 的表達(dá)和純化 利用 Primer5 軟件設(shè)計(jì)引物， 擴(kuò)增 cbxynA 的 ORF 編 碼 序 列 。 在 序 列 N 端 正 （5’ -CATGCCATGGCACACGTACACGTCCCG-3’） 引入 Xho I 位 點(diǎn) ， 在 C 端 （5’ -CCGCTGAGGCAGGCTGCGAAAAGCCC-3’）引入 Nco I 位點(diǎn)。 將目的基因 cbxynA 經(jīng) Xho I 和 Nco I 雙 酶 切 后 連 接 到 pET-28a （+） 載 體 并 轉(zhuǎn) 化 到 BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)。 對(duì)表達(dá)過程 中何時(shí)加入 IPTG 的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、加入 IPTG 誘導(dǎo)后 的溫度、 誘導(dǎo)的時(shí)間及 IPTG 濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu) 化。 收集菌體后用裂解液裂解，超聲波破碎細(xì)胞后 離心收集上清粗酶液。 用 Ni 柱純化粗酶液，先用2.5% wash&elution buffer 對(duì)柱料進(jìn)行沖洗， 通過 A280 檢測(cè)器對(duì)除雜蛋白情況進(jìn)行監(jiān)控，直至檢測(cè) 器顯示沒有雜峰的出現(xiàn)。 用 wash & elution buffer 對(duì)柱料進(jìn)行梯度洗脫 ， 梯 度 分 別 為 5% ，10% ， 20%，40%，60%，80%，100%。并將對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間 的蛋白進(jìn)行收集。 用 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)純化后 的酶蛋白。

1.8 重組酶

CBXYNA 活力及酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定 以木聚糖為底物， 采用 DNS 法測(cè)定酶活力。 酶最適 pH 值和 pH 穩(wěn)定性測(cè)定緩沖液體系為 pH 值 2.2～11。每種緩沖體系 5 個(gè)點(diǎn)，共 35 個(gè)點(diǎn)。重組 CBXYNA 酶活力的測(cè)定在 50 ℃下進(jìn)行，將常規(guī)方 法中的緩沖液替換為上述不同 pH 體 系 的 緩 沖 液，測(cè)定所得酶活力記為 100%。 pH 穩(wěn)定性是將酶 液稀釋，使酶液處于不同的緩沖體系中，50 ℃下保 溫 30 min 后立即冰浴終止反應(yīng)，之后按照 DNS 測(cè) 定方法測(cè)定殘余酶活力， 以未經(jīng)保溫處理的重組 木聚糖酶 CBXYNA 活力為 100%， 分別計(jì)算不同 pH 下的殘余相對(duì)酶活力。 測(cè)定最適溫度時(shí)， 用最適 pH 緩沖液將酶稀 釋一定比例，然后置于 40～80 ℃的不同溫度下，反 應(yīng) 10 min，測(cè)定酶活力，以最大值為 100%。溫度穩(wěn) 定性的測(cè)定， 將樣品與酶最適反應(yīng)緩沖溶液以一 定比例混勻，置于不同溫度（50，55，60，65，70 ℃） 中保溫不同時(shí)間 （0，30 min，1 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，5 h）。 定時(shí)取樣，測(cè)定樣品殘留酶活力，以未處 理木聚糖酶活力作對(duì)照。 考察的金屬離子 Na+ 、K+ 、Li+ 、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì) CBXYNA 酶活力的影響。 酶 對(duì)底物特異性的研究，添加 1%（w/v）的燕麥木聚 糖、樺木木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖、水不溶性 玉米芯木聚糖在 0.05 mol/L，pH 5.2 的 醋 酸 緩 沖 液中，反應(yīng)時(shí)間為 10 min，反應(yīng)溫度為 55 ℃條件 下測(cè)定木聚糖酶活力。

2 結(jié)果與分析

從土壤中提取總的 DNA，經(jīng)純化濃縮后的 23 kb 以上的 DNA 的量約為 6 μg。 因土壤環(huán)境中得 到的總 DNA 片段較長(zhǎng)，不利于外源片段插入載體 中。 故采用 Sau3A I 酶對(duì)回收的土壤 DNA 片段 進(jìn)行部分酶切， 再用 1%的瓊脂糖凝膠回收 2～10 kb 以內(nèi)的 DNA 片段約 2 μg 左右。將酶切時(shí)間設(shè)置為 1 h， 每 100 μL 加入 0.75 U 的 Sau3A I 酶，使得土壤 DNA 的條帶分布在 2～ 8 kb，符合構(gòu)建質(zhì)粒土壤宏基因組文庫。 酶切之后 的土壤 DNA 與 pUC19 載體經(jīng) T4 連接酶連接后， 導(dǎo)入到 DH5α 中。 將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板后獲得了 大量宏基因文庫克隆子。 從文庫中隨機(jī)提取 10 個(gè) 克隆子并提取質(zhì)粒，用 EcoR I 和 Hind III 雙酶切 之后，結(jié)果表明：質(zhì)粒間插入的外源酶切帶型差異 顯著，文庫克隆片段隨機(jī)性較高。 外源插入大小為 1.5～4.5 kb，平均為 3 kb，粗略計(jì)算，宏基因組的庫 容量為 30 Mb。將篩選得到的陽性克隆子 Cb5545 測(cè)序，得到 一段 4 238 bp 的 DNA 序列，并預(yù)測(cè)了該外源插入 片段的所有可能開放閱讀框， 其中開放閱讀框 ORF10 是一個(gè) 822 bp 長(zhǎng)的編碼木聚糖酶的完整 的開放閱讀框， 其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與來自 Halobacteriaceae archaeon（古細(xì)菌屬）編碼的木聚 糖酶的相似度最高也僅為 45%， 表明該序列是一 條未知的新序列 （GenBank 登記號(hào)：KY062986）。 該基因編碼的產(chǎn)物由 273 個(gè)氨基酸組成， 預(yù)測(cè)的 分子質(zhì)量為 29.1 ku，等電點(diǎn)為 5.2。將目的基因 cbxynA 克隆到 pET-28a（+）表達(dá) 系統(tǒng)里進(jìn)行異源表達(dá)。 對(duì)重組質(zhì)粒何時(shí)加入 IPTG 誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)、加入 IPTG 后的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度 及 IPTG 濃度進(jìn)行優(yōu)化。 最終的優(yōu)化結(jié)果如圖 4 所 示。 結(jié)果表明：培養(yǎng) 5 h 后，添加 IPTG 終濃度為 0.7 mmol/L，在 23 ℃下誘導(dǎo) 25 h，獲得的最大酶活 力為 52 U/mL，較初始值提高了 4.3 倍。

3 結(jié)論

研究從土壤宏基因文庫中篩選并鑒定出一個(gè) 木聚糖酶基因 cbxynA，經(jīng)分析表明該基因是一段 未知的新序列。 隨后對(duì)該基因進(jìn)行克隆表達(dá)，對(duì)其 原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化， 最終獲得其最大酶活 力為 52 U/mL，較初始值提高了 4.3 倍。 重組木聚糖 酶 CBXYNA， 其 最 適 pH 為 5.2，pH 在 4.2 到 10.2 之間時(shí)其酶活力在 70%以上， 有較好的 pH 穩(wěn)定性。 CBXYNA 的最適溫度為 55 ℃，在 50～60 ℃保溫 30 min 酶活力仍在 80%以上， 具較好的熱 穩(wěn)定性。 Na+ 、K+ 、Ca2+、Li+ 在 1～7 mmol/L 的范圍之 內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用，Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用， 且抑制作用隨著金屬離子濃度的升 高而增強(qiáng)。其中，Cu2+對(duì)酶的抑制作用最明顯，幾乎 使其完全喪失酶活。 當(dāng)該酶以水溶性玉米芯木聚 糖、燕麥木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖、酶活力 分別為 162%，139%，74%， 說明該 CBXYNA 更容 易結(jié)合水解水溶性木聚糖底物。 重 組 木 聚 糖 酶 CBXYNA 有較好的 pH 穩(wěn)定性， 可用于造紙、飼 料、食品等工業(yè)應(yīng)用中。 同時(shí)該酶以燕麥木聚糖、 水溶性玉米芯木聚糖為底物時(shí)，酶活力相對(duì)較高， 有較強(qiáng)的親和能力， 可被用于水解可溶性木聚糖 底物制備低聚木糖。