淫羊藿苷( ICA) 是中藥淫羊藿的有效成分。淫 羊藿為小檗科多年生草本植物，歸肝、腎經(jīng)，性溫，味 辛、甘。《本草綱目》記錄了淫羊藿其有“益精氣、堅(jiān)筋骨、實(shí)腰膝心力”的效果。淫羊藿苷是從淫羊藿 屬植物中分離得到的黃酮醇苷類化合物。對治 療骨質(zhì)疏松癥類疾病效果顯著且不良反應(yīng)小。淫羊 藿及淫羊藿提取物通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)作 用來激活成骨細(xì)胞的增殖分化及抑制破骨細(xì)胞的作 用來促進(jìn)骨的形成、抑制骨吸收，構(gòu)建骨的平衡，進(jìn) 而有效地防治骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。淫羊藿苷 的分子機(jī)制已經(jīng)證明其抗骨質(zhì)疏松和成骨分化作 用以及其參與雌激素生物合成。

出生 72 h 的 SD 乳鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動 物 實(shí) 驗(yàn) 中 心 提 供。動物合格證編號為 SCXK 黑 2015004。

淫羊 藿 苷 ( meilunbio，中 國) ，LiCl ( Sigma，美 國) ，胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合 液和 胰 酶 ( Hyclone，美 國) ，CCK8 ( 同仁，日 本) ， GSK3β、p-GSK3β、β- catenin、GAPDH 抗 體 購 于 Abcam 公司，維生素 C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松 ( Sigma，美國) 。茜素紅染液( 索萊寶，中國) ，PNPP ( 大連美倫，中國) 。

無菌條件下取出出生 72 h 的 SD 乳鼠頭骨，置 入 4°C 的 PBS 溶液中，然后應(yīng)用眼科鑷與手術(shù)刀剔 除表面的結(jié)締組織，用 4°C 的 PBS 溶液反復(fù)吹打清 洗組織并將其剪成小于 1 mm3 的組織塊，將剪好的 組織塊轉(zhuǎn)移到 1. 5 mL 離心管中，加 3 倍體積的胰 酶，將離心管置入 37 ℃ 的脫色搖床（TS-1000型）中進(jìn)行消化，振 蕩消化 20 min 后加入胎牛血清終止消化，放置于 4 ℃ 冰 箱 中 靜 置 5 min，舍 棄 上 清 液，加 入 0. 2% Collagenase I，置于 37 ℃的脫色搖床中，消化并振蕩 60 min 后用胎牛血清終止消化，多次吹打后通過 200 目濾網(wǎng)過濾去除碎片，收集濾液，1 200 r /min 離心 8 min，棄上清液，用 DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行重 新懸浮細(xì)胞，置于 37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培 養(yǎng); 2 d 后換液，之后間隔 2 ～ 3 d 換 1 次培養(yǎng)液。并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，取培養(yǎng) 的第三代成骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

稱取一定量的 ICA，用 DMSO 溶解，配制成為 200 μmol /L 的 ICA 貯備液，使用前用 DMEM 基礎(chǔ)培 養(yǎng)液稀釋所需濃度，使 DMSO 的終濃度＜ 0. 1%。將 成骨細(xì)密度調(diào)整為 104 /mL 接種于 96 孔培養(yǎng)板中進(jìn) 行培養(yǎng)，每孔加入 200 μL 置于 5% CO2 的 37 ℃ 培 養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底 80%以上每孔中 加入 ICA 終濃度為 0、10、20、40、80 nmol /L 進(jìn)行繼 續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 進(jìn)行繼 續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，用酶標(biāo)儀讀取波長為 490 nm 處的吸 光度值。

將成骨細(xì)胞密度調(diào)整為 104 /mL 接種于 96 孔培 養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入 200 μL 置于 5% CO2 的 37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底 80%以上 每孔中加入 LiCl 終濃度為 0、2、5 nmol /L 進(jìn)行繼續(xù) 培養(yǎng) 24 h 后，每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 進(jìn)行繼續(xù) 培養(yǎng) 4 h 后，用酶標(biāo)儀讀取波長為 490 nm 處的吸光 度值。

將成骨細(xì)胞細(xì)密度調(diào)整為 104 /mL 接種于 96 孔 培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入 200 μL 置于 5% CO2 的 37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底 80% 以上時(shí)將相應(yīng)的孔板分為 4 組即空白組、ICA 組( 80 nmol /L) ，LiCl( 5 nmol /L) ，ICA( 80 nmol /L) +LiCl( 5 nmol /L) 組，加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng) 24 h， 每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后， 用酶標(biāo)儀讀取波長為 490 nm 處的吸光度。

用第三代成骨細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)，在礦化誘 導(dǎo)培養(yǎng)基( 100 nmol /L 抗壞血酸、10 mmol /L β-甘油 磷酸、7 mol /L 地塞米松) 下培養(yǎng)。各組分別加入相 應(yīng)濃度藥物。接種于培養(yǎng)板中，分為空白組( 礦化 誘導(dǎo)培養(yǎng)基) 、ICA 組( 80 nmol /L) ，LiCl 組( 5 nmol / L) ，ICA( 80 nmol /L) +LiCl( 5 nmol /L) 組，空白組給 予空白誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行誘導(dǎo) 21 d 后棄掉培養(yǎng)液， 培養(yǎng)板用 PBS 溶液沖洗 3 次，室溫下使用 95%乙醇 固定 15 min，雙蒸水沖洗 3 次，0. 1%茜素紅［茜素 紅-Tris-Hcl( pH 8. 3) ］染色，放置培養(yǎng)箱中 1 h，使用 雙蒸水沖洗 3 次。PNPP 法測定成骨細(xì)胞 ALP 活 性，成骨細(xì)胞培養(yǎng) 21 d 后棄培養(yǎng)液，應(yīng)用 PBS 溶液沖洗 2 遍，使用 1% Triton X-100 反復(fù)凍融 3 次，成 骨細(xì)胞裂解物孵育在磷酸鹽底物中 30 min，溫度為 37 ℃，進(jìn)而加入 1 mol /L 的 NaOH 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀 在 405 nm 下測定其吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化 的 Sigma 校正曲線，計(jì)算各組成骨細(xì)胞酶活性。

將成骨細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，接種 24 h 左 右細(xì)胞貼壁，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 延伸出較多的突起，在 培養(yǎng)到 7 ～ 10 d 后細(xì)胞融合為單層細(xì)胞，細(xì)胞多為 單核、多邊形及梭形等，如圖 1 所示。CCK-8 法檢測結(jié)果顯示與空白組 比較，ICA 組、LiCl 組和 LiCl 與 ICA 聯(lián)合組對成骨 細(xì)胞的增殖具均有促進(jìn)作用，與淫羊藿苷組和氯化 鋰組比較，淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰組對成骨細(xì)胞的增 殖更具有明顯促進(jìn)作用。，CCK-8 法檢測結(jié)果顯示一定濃度 下氯化鋰都能對成骨細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同程度的促進(jìn) 作用，并且各不同濃度組的 OD 值比較，差異具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。CCK-8 法檢測結(jié)果顯示不同濃度 的 ICA 都能對成骨細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同程度作用，但 是低濃度差異不顯著。成骨細(xì)胞生長率隨著淫羊藿 的濃度升高而增加。結(jié)果表明淫羊藿 苷、氯化鋰、淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰處理的成骨細(xì)胞的礦化能力明顯增加，相對于空白組，ICA 組、LiCl 組 和 LiCl 與 ICA 聯(lián)合組的成骨細(xì)胞礦化能力明顯增 加，與 空 白 組 比 較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P ＜ 0. 05) ，且以 LiCl 與 ICA 聯(lián)合組處理細(xì)胞鈣化能力最強(qiáng)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨的微觀結(jié)構(gòu)減弱為主要表現(xiàn) 特征，骨強(qiáng)度下降和骨脆性增加為主要臨床表 現(xiàn)，多發(fā)生于老年人群，嚴(yán)重危害著患者的生活 質(zhì)量。骨質(zhì)疏松由于成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞生理狀態(tài) 異常所致。近年來的研究已經(jīng)證明，淫羊藿苷可 通過上調(diào)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子 α1 ( Cbfα1) 、 BMP-2、BMP-4 mＲNA 和 Ｒunx2 的表達(dá)而促進(jìn)成骨 細(xì)胞骨形成。經(jīng)典 Wnt /β-catenin 信號通路在成骨細(xì)胞的生 成及骨形成過程中起到重要的作用，而淫羊藿苷+ 氯化鋰組通過調(diào)節(jié) Wnt 信號通路 GSK-3β 的磷酸化 從而抑制胞質(zhì)內(nèi) β-catenin 的磷酸化和降解，進(jìn)而增 加胞質(zhì)內(nèi) β-catenin 聚集并轉(zhuǎn)入細(xì)胞胞核。從而激 活下游靶基因促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。



 

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