肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）-肝硬化-肝癌是 慢性肝病發(fā)展中的三步曲，HF 與早期肝硬化是可逆 的，因此阻止及逆轉(zhuǎn) HF 的發(fā)展，揭示 HF 新的發(fā)病 機(jī)制，一直是肝病研究的熱點(diǎn)。自噬在 HF 的發(fā)病機(jī) 制中發(fā)揮著重要的作用。肝細(xì)胞自噬可適應(yīng)急性應(yīng) 激，亦可導(dǎo)致肝細(xì)胞自噬性死亡。

SD 大鼠 70 只，SPF 級(jí)，5 周齡，雌雄各 半，體質(zhì)量 140～180 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2014-0001， 合格證編號(hào)：NO. 201600292。

FRF 組成：黃芪（批號(hào)：1504001w）7.5 g、 白術(shù)（批號(hào)：1502001w）6 g、苡仁（批號(hào)：1502001s） 6 g、 丹 參（批 號(hào) ： 1503002s）4.5 g、 當(dāng) 歸（批 號(hào) ： 1502002w）4.5 g、牛膝（批號(hào)：1502001w）6 g、莪術(shù) （批號(hào)：1503001w）1.5 g、蒼術(shù)（批號(hào)：1502001w）2.5g、枳殼（批號(hào)：1410001w）2.5 g，配方顆粒劑為華潤(rùn) 三九醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第 一附屬醫(yī)院中藥房提供。秋水仙堿片（國(guó)藥準(zhǔn)字 H53021904），玉溪生物制藥有限公司。扶正化瘀膠 囊（國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20020073），上海黃海制藥有限責(zé)任 公司。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào)：2015035）、谷 草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào)：2015013）、白蛋白（ALB，批 號(hào)：2015030）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（γ-GGT，批號(hào)： 2016001）及總膽紅素（TBIL，批號(hào)：2016013）試劑 盒，均為長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；α-SMA， （批 號(hào) ： E1A1032）、 Beclin- 1（批 號(hào) ： E1A5128）、 LC3-Ⅱ（批號(hào)：E1A4007）、GAPDH（批號(hào)：E1C604- 1）抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào) E1WP318）、 RIPA 裂解液、BSA、預(yù)染蛋白 Marker、顯影液、定 影液、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京恩晶 生物科技有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)： P0018A），上海碧云天生物技術(shù)公司；DMSO，美國(guó) Sigma 公司；PVDF 膜，美國(guó) Millipore 公司；Maxisignal Western Solution（SUDGEN，批號(hào)：15101215/16），南 京南晶生物公司； TRIpure Reagent（Aidlab，批號(hào)： 272026AX）， 北 京 艾 德 萊 生 物 公 司 ； OneScriptTM cDNA Synthesis Kit（G234）、 EvaGreen Express2 × qPCR Master Mix-ROX，均為加拿大 ABM 公司產(chǎn)品。

ECA-2000A 型全自動(dòng)生化分析儀，吉林 維爾醫(yī)療器械有限公司；VE 180 型微型垂直電泳 槽、VE 186 型轉(zhuǎn)移電泳槽、EPS 300 型電泳儀，上 海天能科技有限公司；TY-80B 型脫色搖床，江蘇省 金壇市榮華儀器制造有限公司；WH-986 型靜音混合 器 ， 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司 ； BSA224S 型 精 密 電 子 天 平 ， 德 國(guó) Satorius 公 司 ；MUTISKAN MK3 型酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo scientific 公 司；TL998-IV 型 Real time PCR 儀，西安天隆科技 公司；TC1000-G 型梯度 PCR 儀、D3024R 型低溫離 心機(jī)，美國(guó) SCILOGEX 公司；FA2004 型電子天平， 上海上平儀器有限公司；H-7500 型透射電鏡，日本 HITACHI 公司。

結(jié)果見表 1。實(shí) 驗(yàn)造模前各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。造模 4 周時(shí)，各造模組體質(zhì)量均低于正 常組，除 FRF 中劑量組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P <0.05）；各造模組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。造模 8 周結(jié)束時(shí)，各造模組體質(zhì)量仍低 于正常組，除模型組、FRF 中劑量組外，差異均有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；各造模組間比較，差異無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù) 4 周結(jié)束時(shí)，各藥物 干預(yù)組體質(zhì)量仍低于正常組，除模型組、FRF 中劑 量組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；但與模型 組比較，各給藥組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。提示 HF 造模能影響大鼠體質(zhì)量，但陽性藥 及 FRF 的干預(yù)作用不明顯。正常組比較，模型組的 ALT、AST、γ-GGT、TBIL 含量顯著增高（P < 0.05，P < 0.01），ALB 含量顯著 降低（P < 0.01）。與模型組比較，F(xiàn)RF 各劑量組的 ALT、AST、TBIL 均顯著下降（P < 0.05，P < 0.01）， ALB 含量顯著升高（P < 0.05，P < 0.01），F(xiàn)RF 中、 高劑量組的 γ-GGT 顯著下降（P < 0.05，P < 0.01）。Masson 切片顯示正常組僅于匯管區(qū)有少量藍(lán)染的膠原纖維分布，無明顯膠原增生。與正常組 比較，模型組大鼠的門管區(qū)藍(lán)染纖維組織增多，中 央靜脈壁增厚，多數(shù)大鼠藍(lán)染的纖維組織自門管區(qū) 或中央靜脈向外延伸，少數(shù)大鼠有纖維隔形成，呈 藍(lán)染；HF 程度分級(jí)經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，與正常組比較差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組 大鼠的肝纖維組織增生程度均有不同程度的減輕， 膠原纖維減少、變細(xì)；肝纖維化程度分級(jí)，除 FRF 低劑量組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

自噬是細(xì)胞降解亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平 衡的生物過程 。Beclin-1 作用于自噬的起始階段， 參與自噬體的形成，是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵基因。 LC3-Ⅱ亦參與了自噬體的形成，是定位于自噬體膜 的結(jié)構(gòu)蛋白，與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，是反映自噬水平高低的重要指標(biāo)，是檢測(cè)自噬活性和自噬體 形成的標(biāo)志基因。自噬在 HF 的能量代謝中起重要 的作用，能促進(jìn) HF 的發(fā)生。在 HF 過程中，肝細(xì)胞 損傷壞死，而 HSC 活化，兩者自噬調(diào)控異常是 HF 的重要病理機(jī)制。CCl4誘導(dǎo)的 HF 小鼠模型中 LC3- Ⅱ表達(dá)增加，體外激活的小鼠 HSC 存在自噬流量增加，提示自噬與 HSC 活化關(guān)系密切。自噬通過降 解脂滴為 HSC 轉(zhuǎn)化為 MFB 提供能量，MFB 大量合 成膠原纖維，促進(jìn) HF 的發(fā)生與發(fā)展 。自噬對(duì)肝細(xì) 胞而言是一把雙刃劍，可能幫助其生存，也可能促 進(jìn)炎癥而損害肝細(xì)胞。自噬對(duì) HSC 具有保護(hù)作用， 能為 HSC 表型轉(zhuǎn)化提供能量，促進(jìn) HF。自噬參與了 HF 發(fā)生的多個(gè)環(huán)節(jié)，可能參與肝細(xì)胞變性壞死，亦 可能助其存活，而在 HSC 活化過程中自噬顯著增 加，自噬抑制劑能抑制 HSC 活化，抑制 HSC 向肌成 纖維細(xì)胞（MFB）轉(zhuǎn)化。