贛南臍橙是對(duì)外貿(mào)易中頗具競(jìng)爭(zhēng)力的農(nóng)產(chǎn)品， 它具有口感好，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富等優(yōu)點(diǎn)。自2000年 以來(lái)，贛南臍橙的種植面積逐漸擴(kuò)大，其病害問(wèn)題也 接踵而至，尤為嚴(yán)重的是柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）。HLB 病原菌有三個(gè)種，流行最 廣 的 是 亞 洲 種（Candidatus liberibacter asisaticus， Las），該病主要通過(guò)木虱和苗木調(diào)運(yùn)進(jìn)行傳播。 HLB 的常見(jiàn)癥狀為黃梢、葉斑駁黃化和紅鼻子果， 該病癥狀很容易與其他柑橘病害混淆，例如柑橘衰 退病染和缺素癥。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與品種

本研究中柑橘黃龍病監(jiān)測(cè) 點(diǎn)在江西贛州市尋烏縣吉譚鎮(zhèn)果園，該果園面積約 為6 hm2 ，品種均為臍橙，樹齡是10 a左右，果園所處 地貌是為南方常見(jiàn)丘陵地形。當(dāng)?shù)毓r(nóng)嚴(yán)格施藥， 對(duì)木虱進(jìn)行嚴(yán)格防控，調(diào)查未發(fā)現(xiàn)木虱。

1.1.2 引物與探針

參照 Li 等設(shè)計(jì)的引物 HLBas/HLBr 和探針 HLBr，以此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件建 立 TaqMan 熒光定量檢測(cè)體系。此外使用 M13F/ M13R驗(yàn)證含有目的片段載體的陽(yáng)性克隆。引物和 探針由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物 和探針詳情。

1.1.3 試劑耗材及儀器

實(shí)驗(yàn)中所用試劑包括植物全基因組 DNA 提取試劑盒（Axygen，美國(guó)），質(zhì)粒小 提試劑盒（Axygen，美國(guó)），Mpbio Fastprep Lysing A 裂 解 介 質(zhì) 管（Axygen，美 國(guó) ），DEPC 水（DNase/ RNase-Free/water）（北京索萊寶科技有限公司，中 國(guó)），Probe qPCR Mix（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限 公司 ，中國(guó)），LB 培養(yǎng)基（Tryptone 15 g，Yeast extract 10 g，NaCl 10 g，pH 7.0），無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán) 化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)），PBS緩沖液（HyClone，美 國(guó)）等。實(shí)驗(yàn)所用儀器有普通離心機(jī)（Eppendorf，德 國(guó)），PCR 儀 和 凝 膠 成 像 分 析 系 統(tǒng)（美 國(guó) ，BIORAD），超低溫冰箱 MDF-382E（SANYO，日本）與恒 溫冰箱（海爾，青島），QuantStudio® 6 Flex及核酸蛋 白分析儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），美國(guó) MPFastPrep-24 5G 研磨機(jī)（MP Biomedicals，美國(guó)），微 孔板離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中 國(guó)）等。

1.2 方法

1.2.1 病害情況調(diào)查方法

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)袁亦文等2010年制定的柑橘黃龍病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將果園分 為 5 個(gè)病級(jí)，其中 1 級(jí)：樹上有 5~6 梢葉片呈現(xiàn)斑駁 黃化癥狀；2級(jí)：部分側(cè)枝或者主枝出現(xiàn)斑駁黃化癥 狀，占全樹的三分之一以下；3 級(jí)：帶有斑駁黃化葉 的側(cè)枝或主枝占全樹的 1/3~2/3；4 級(jí)：帶有 HLB 癥 狀樹枝占三分之二以上；5級(jí)：全樹接近死亡。從1~ 5級(jí)區(qū)分別選取5株樹，共25株樹。

1.2.2 植物組織總DNA提取

稱取約 100 mg柑橘 葉片中脈，切碎后裝入Mpbio Fastprep Lysing A裂解介質(zhì)管，加入 500 mL PBS 緩沖液，用 MP FastPrep24 5G 研磨機(jī)研磨，程序設(shè)置：speed 6 m·s -1 ，time 40 s，Quantity 100 mg，cycles 2，pause time 300 s。植物 總 DNA 試 劑 盒 提 取 方 法 參 照 Axygen® 的 Multisource Genomic DNA Miniprep kit 250-prep 說(shuō)明書， 將提取的DNA放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

由北京六合華大科技公 司將HLBas/HLBr擴(kuò)增片段連接到pUC57-simple載 體上 ，再轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中 ，使用引物 M13F/ M13R進(jìn)行50 mL體系的PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證有條帶的陽(yáng) 性菌液送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序 ，利用 DNAMAN比對(duì)驗(yàn)證。取陽(yáng)性菌液，利用質(zhì)粒小提試劑盒 提取質(zhì)粒。

1.2.4 質(zhì)粒模板拷貝數(shù)計(jì)算公式

使用核酸蛋白分 析儀測(cè)定核酸濃度，將其作為 Las 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。將 DNA 的質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為模板拷貝數(shù)（copy number， CN）:CN=（M×N）（/ L×D），M=質(zhì)量濃度（g · mL- 1 ）= DNA（ng · mL- 1 ）×10- 6 ，N=阿伏伽德羅常數(shù)（6.022× 1023分子/摩爾），L=核酸分子長(zhǎng)度（總長(zhǎng)度=靶片段+ 載體，單位 kb），D=轉(zhuǎn)換因子（對(duì) dsDNA 為 6.6×105 g·mol-1 ·kb-1 。

2 結(jié)果與分析

將 HLBas/HLBr 擴(kuò)增片段連接到 pUC57-simple 上得到載體pUC57-Las，使用引物M13F/M13R擴(kuò)增 得到 211 bp特異條帶。測(cè)序后使用 DNAMAN進(jìn)行 序 列 比 對(duì) ，與 Las 基 因 組 中 相 應(yīng) 序 列 相 似 性 為 100%，驗(yàn)證結(jié)果正確。標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 y=- 3.369 lg（x）+ 15.738（R2 =0.999， Eff%=98.068）。 y 為 CT 值 ，x 為 DNA 濃 度 ，單 位 ng · mL-1 。將 DNA 濃度轉(zhuǎn)化模板拷貝數(shù)，得到公式 Y=−3.369 lg（CN）+44.422（Y 為 CT 值，CN 為模板拷 貝數(shù)）。

3 討 論 

對(duì)江西省贛州地區(qū)柑橘黃龍病菌在染病 柑橘樹體內(nèi)的流行動(dòng)態(tài)規(guī)律進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在 2017 年 8 月到 2018 年 10 月，Las 在樹體內(nèi)的含量會(huì) 隨著時(shí)間變化而波動(dòng)大體呈現(xiàn)出 2個(gè)高峰和 2個(gè)低 谷，總體表現(xiàn)為 2017 年 8 月開(kāi)始 Las 含量先增后降的變化規(guī)律。胡浩研究了廣西柳州地區(qū)染病柑橘 樹內(nèi) Las含量的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示在 10 月柑橘黃 龍病菌含量達(dá)到最高值，在 3 到 5 月維持在較低水 平。Wang等研究顯示Las在染病柑橘樹體內(nèi)變化 規(guī)律為在 10月和 12月柑橘黃龍病菌含量達(dá)到最高 值，3月和5月維持在較低水平。以上研究均發(fā)現(xiàn)在 10月份病樹內(nèi)的 Las含量會(huì)達(dá)到高峰，5月 Las含量 處于低谷，但本研究中江西柑橘果園內(nèi)病樹的 Las 含量在 6 月也呈現(xiàn)出 1 個(gè)高峰。該時(shí)段的 Las 含量 較 10 月份的 Las 含量低，但仍是低谷時(shí)期 Las 含量 的 10 倍以上。本研究的結(jié)果與前人研究結(jié)果存在 差異的原因可能是不同果園地理位置氣候或者柑橘 自身生長(zhǎng)規(guī)律的差異導(dǎo)致的。此外本研究果園里的 木虱受到果農(nóng)嚴(yán)格控制，定期施藥，所以木虱對(duì)植株 體內(nèi) Las 的含量影響較小，與前人的研究結(jié)果相互 對(duì)比分析，木虱對(duì)病樹后期 Las 含量的變化影響不大。



 

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