肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumonia) 是引起肺 炎、腦膜炎、中耳炎及敗血癥的主要病原之一，特別 在兒童和老年人中。接種疫苗是預(yù)防肺炎鏈球 菌相關(guān)疾病的重要手段，為了保證肺炎鏈球菌疫苗 的質(zhì)量，WHO 建議肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗的臨床評價 應(yīng)以型別特異性抗體水平作為第一臨床終點的判斷指標。

1 材料與方法

1．1 胎牛血清

5 個不同品牌的胎牛血清( 簡稱品 牌 1～5) 分別購自美國 Gibico 公司、Clark 公司、Corning 公司、Seropro 公司和杭州四季青公司。

1．2 菌種、細胞

13 株肺炎鏈球菌菌株均來自中國 醫(yī)學細菌保藏管理中心。其中，CMCC( B) 33273( 1 型) 、33278( 6B 型) 、33284( 19F 型) 均為壯觀霉素 ( spectinomycin) 抗性; CMCC( B) 33274( 3 型) 、33275 ( 4 型) 、33279( 7F 型) 、33279( 18C 型) 均為奧普托 欣( optochin) 抗性; CMCC ( B) 33276 ( 5 型) 、33280 ( 9V 型) 、33281( 14 型) 均為鏈霉素( streptomycin) 抗性，CMCC ( B) 33277 ( 6A 型) 、33283 ( 19A 型) 、 33285( 23F 型) 均為甲氧芐氨嘧啶( trimethoprim) 抗 性。HL60 細胞購自美國 ATCC( CCL-240) ，由中國 食品藥品檢定研究院保存并提供。

1．3 質(zhì)控血清

007sp 購自英國生物制品檢定所 ( National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC) ; 920 由蘭州生物制品研究所有限責任 公司惠贈; 2009S 由中國食品藥品檢定研究院呼吸 道細菌疫苗室制備。

1．4 主要試劑及儀器

ＲPMI1640 培養(yǎng)基、谷氨酰 胺、Hanks 緩沖液( HBSS) 均購自美國 Gibco 公司; 二甲基甲酰胺( DMF) 購自美國 Fisher 公司; 家兔補 體由中國食品藥品檢定研究院呼吸道細菌疫苗室制 備; Todd Hewitt Broth、酵母粉、瓊脂粉均購自美國 BD 公司; 壯觀霉素、奧普托欣、鏈霉素、甲氧芐氨嘧 啶、2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) 均購自 Sigma 公司。顯微 鏡 購 自 Olympus 公 司; CO2 培 養(yǎng) 箱 購 自 Thermo 公司; 微孔板振蕩器購自其林貝爾公司; 菌落計數(shù)器 ProtoCOL3 購自 Synbiosis 公司。

1．5 不同品牌血清用于 HL-60 分化后細胞活力的比較

培養(yǎng)時間相同的增殖 HL-60 細胞，取一定體 積計數(shù)，分裝至 5 支離心管中，使每支離心管中有 4×107 個細胞，以離心半徑 8 cm、1 500 r/min 離心 5 min; 用品牌 1 ～ 5 的胎牛血清配制用于 HL-60 分 化的細胞培養(yǎng)基 CM2，輕輕重懸細胞沉淀; 將體 積加至 100 mL，于 37 ℃ 0．5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～ 6 d 后，以離心半徑 8 cm、1 500 r/min 離心 5 min，去 上清; 分別用1×HBSS 緩沖液( 無 Ca2+ 、Mg2+ ) 和 1× HBSS 緩沖液( 含 Ca2+ 、Mg2+ ) 清洗細胞，用臺盼藍染 色記錄活細胞和死細胞的數(shù)量，計算細胞活力。

1．6 不同品牌血清分化的細胞對 13 個不同肺炎鏈球菌血清群/型調(diào)理吞噬作用的影響

用品牌 1 配 制的 OBB 將上述不同胎牛血清分化的細胞濃度調(diào) 整為 1×107 個/mL。OPA 滴度檢測采用可同時檢測 4 種血清型的多型調(diào)理吞噬試驗( multiplexed opsonophagocytic killing assays，MOPA) ，具體操作流程 見參考，每輪 MOPA 中的每份質(zhì)控血清均 平行測定 2 次。當對照孔菌數(shù)的平均值在 70 ～ 180 CFU/spot，非特異殺菌率≤70%時，計算每份質(zhì)控血 清的調(diào)理指數(shù)( opsonic index，OI) ，取平均值作為每 輪試驗的結(jié)果值，重復(fù) 3 次，計算每份質(zhì)控血清調(diào)理 指數(shù)的平均值和標準差。

1．7 不同品牌血清配制成 OBB 后對 13 個不同肺 炎鏈球菌血清群/型調(diào)理吞噬作用的比較

用品牌 1 配制的 CM2 培養(yǎng)基培養(yǎng) HL-60 5～6 d 后，按照 1．5 項方法處理細胞，最后用不同品牌血清配成的 OBB 調(diào)整細胞濃度為 1×107 個/mL。MOPA 試驗及結(jié)果 計算按照 1．6 項方法進行。

1．8 統(tǒng)計學分析

1．8．1 細胞活力的比較

采用 IBM SPSS Statistics 19．0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)均以 x 珋± s表示，多組間比較采用單因素方差分析 ( oneway ANOVA) ，以品牌 1 為對照，比較與其余品牌的 差異，P＜0．05 時，差異有統(tǒng)計學意義。

1．8．2 調(diào)理指數(shù)的計算及分析

采用 Opsotiter3 軟 件計算 OI 值，實驗數(shù)據(jù)均以 x 珋± s 表示。

2 結(jié) 果

品牌 1 胎牛血清分化細胞的活力最高，為86．80%; 品牌 4 分化細胞的活力次之( 76．23%) ; 品牌 2 和 3 分化細胞的活 力相近 ( 分 別 為 71． 24% 和 72．73) ; 品牌 5 分化細胞的活力最低( 64．80%) 。與品 牌 1 胎牛血清分化細胞的活力相比較，品牌 2、3、4 分 化細胞的活力，差異均無統(tǒng)計學意義( P 值分別為 0．129、0．186、0．440，P＞0．05) ，而品牌 5 分化細胞的活 力，差異有統(tǒng)計學意義( P= 0．023，P＜0．05)。

3 討 論

為保證疫苗質(zhì)量，所有肺炎鏈球菌疫苗上市前 均需進行免疫保護效力測定。肺炎鏈球菌疫苗的保 護機制主要是通過特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用 將體內(nèi)的肺炎鏈球菌清除。通過 OPA 檢測抗體的 調(diào)理吞噬活性，能夠直接反映功能性抗體含量，實現(xiàn) 對疫苗保護效力的準確評估。OPA 技術(shù)在國內(nèi) 外疫苗監(jiān)管體系中受到越來越多的重視，2013 年美 國惠氏公司的 13 價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗在歐洲被 批準用于 50 歲以上成人使用時，采用 OPA 技術(shù)進 行臨床效果評價; 2015 年美國默沙東公司新注冊的 15 價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗使用 OPA 進行了臨床評價; 近年來，我國新藥評審機構(gòu)要求肺炎鏈球菌 疫苗上市前需對一定比例的臨床樣本采用 OPA 進 行臨床效果評價。OPA 的穩(wěn)定性和可重復(fù)性是臨 床效果評價的前提條件，而胎牛血清作為細胞分化 和調(diào)理緩沖液配制中的重要試劑，在美國阿拉巴馬 大學發(fā)布的“肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體多型 調(diào)理吞噬試驗手冊”中明確規(guī)定“由于非特異殺傷 等問題，需要對配制 OBB 的胎牛血清進行篩選。” 胎牛血清的主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、激素等，在含 量或特殊成分濃度、質(zhì)量的差別可以對細胞的生長 造成影響。胎牛血清成分復(fù)雜，而促進細胞生長 的作用機制也同樣復(fù)雜，目前仍有某些成分不清楚 或者作用機理尚在探索中。



 

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