胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在國家癌癥中心發(fā)表在《中國腫瘤》雜志上，關(guān)于 2013 年中國惡性腫瘤發(fā) 病和死亡分析的報告中指出，我國 2013 年胃癌發(fā)病率為 42． 7 /萬，排在所有腫瘤的第 2 位; 死亡率為 30． 1 /萬，排在 所有腫瘤的第 3 位。腸上皮化生( intestinal metapalsia，簡稱 IM) 以及上皮內(nèi)瘤變( intraepithelial neoPLasia，簡稱 IEN) 是 胃炎向胃癌轉(zhuǎn)化的“黃金轉(zhuǎn)折點”，此時，更需要積極的治療。

1 材料

1． 1 動物

選取健康的 SPF 級雄性 Wistar 大鼠 120 只，體 質(zhì)量均為( 200 ± 20) g，所有大鼠均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)的 動物實驗中心所提供，許可證號: SYXK( 黑) 2013 － 012。實 驗動物飼料由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，飼料 分為兩種，分別是普通飼料以及含 0． 3 g /kg 雷尼替丁的標(biāo) 準(zhǔn)飼料。

1． 2 藥品與試劑

欣胃顆粒: 由黃芪、石斛、三棱、半枝蓮 等藥物組成，所有中藥材均購自于哈藥集團世一堂中藥飲 片有限責(zé)任公司。欣胃顆粒的凍干粉均為黑龍江中醫(yī)藥大 學(xué)中醫(yī)藥研究院所提供，具體制備得方法如下: 將欣胃顆粒 中各種藥物根據(jù)原方比例相混合，加 10 倍量的水浸泡 30 min，回流提取 1 h，經(jīng)處理后，過濾后的濾渣再加 8 倍量水 回流提取 1 h，過濾，合并兩次濾液，最后濃縮。經(jīng)冷凍干燥 ( 制備工藝如下: － 40 ℃制冷，－ 20 ℃ 保凍 2 h，－ 10 ℃ 保 凍 16 h，20 ℃干燥5 h，35 ℃二次干燥2 h) ，制成凍干粉，分 裝，密封后 4 ℃避光保存。每 1 g 凍干粉含欣胃顆粒生藥 量 16． 34 g。胃復(fù)春: 由紅參、香茶菜、枳殼等藥物組成，由 杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，0． 36 g /片，國藥準(zhǔn)字 Z33020146，60 片/瓶。用前研碎，加蒸餾水配置成 0． 032 g / mL 的混懸 液。N － 甲 基 － N’－ 硝 基 － N － 亞 硝 基 胍 ( MNNG) : 日本東京化成工業(yè)株式會社批號: ZG4T1 － FP; APS、DTT、Bis － Acrylamide: 美 國 Amresco 公 司; DL2000 DNA Marker、PrimeScript TM ＲT reagent Kit with gDNA Eraser、 SYBＲ Premix Ex TaqTM II ( Tli ＲNaseH Plus) ，ＲOX plus: TaKaＲa( 寶生物) 工程有限公司; 2，4，6 － 三硝基酚: 臺山市 化工廠有限公司; 生理鹽水; 哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司; 兔 抗多 克 隆 一 抗: 北 京 博 奧 森 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司; 二 抗 PV6001、DAB 顯色劑: 北京中杉金橋生物有限公司; 蛋白酶 抑制劑: 瑞士 Ｒoche 公司; 引物合成: 美國 Invitrogen 公司; 5 × 還原樣品緩沖液: Beyotime 生物科技有限公司; BCA 蛋 白定量試劑盒: Beyotime 生物科技有限公司; 蛋白抽提試 劑、2 mg /mL BSA 標(biāo)準(zhǔn)品: Beyotime 生物科技有限公司。

1． 3 儀器

AL104 型電子天平、AL204 型電子天平: 意大 利梅特勒公司; ABI7500 熒光定量 PCＲ 儀: 美國 Applied Biosystems 公司; Centrifuge 5415D 離心機: 德國艾本德 Eppendorf 公 司; Fresco 低 溫 冷 凍 離 心 機、MultiSkan3 酶 標(biāo) 儀、NANODＲOP 2000 分光光度計: 美國 Thermo scientific 公司; Mini P － 4 電泳槽: 北京凱元信瑞儀器有限公司; Moticam3000 攝影顯微鏡: 美國 Moticam 公司; QL － 902 渦旋振 蕩儀: 江蘇其林貝爾儀器有限公司; ＲM2135 病理組織切片 機: 德國 LEICA VLTＲACUT 公司 WD900 型格蘭仕微波爐: 廣東順德電器有限公司; 液氮生物容器: 成都金鳳液氮容器 有限公司; － 80 ℃ 低溫冰箱: 美國 Thermo 熱電公司; Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng): 上海天能科技有限公司; 電熱恒溫干 燥箱: 上海一恒科學(xué)儀器有限公司; 電熱恒溫水浴鍋: 上海 博迅實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠; 電動組織勻漿器: 美國 Sigma 公司; 濕轉(zhuǎn)電泳槽: 北京凱元信瑞儀器有限公司; 電泳儀: 美國 Bio － Ｒad 公司; 水平脫色搖床: 江蘇其林貝爾儀器有限公 司; 半干槽: 美國 Bio － Ｒad 公司; 酸度計 pH211: 意大利 Hanna 公司。

2 方法

40 只健康雄性 Wistar 大鼠根 據(jù)體質(zhì)量編號，根據(jù)隨機數(shù)字表法將其隨機分為 4 組，即空 白對照組( N，n = 10) 、欣胃顆粒組( X，n = 10) 、胃復(fù)春對照 組( W，n = 10) 、模型對照組( M，n = 10) 。先將 40 只健康的 雄性 Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d，并觀察大鼠的狀態(tài)，在無 異常情況的狀態(tài)下，可以將其納入實驗。除 N 組以外，其 余 3 組大鼠均參與造模，動物造模采用以 N － 甲基 － N’－ 硝基 － N － 亞硝基胍( MNNG) 為基礎(chǔ)的多因素復(fù)合造模 法，具體造模方法如下: ①含 0． 3 g /kg 雷尼替丁的標(biāo)準(zhǔn)飼 料喂養(yǎng); ②60 ℃濃度為 150 g /L 的熱鹽水每天 10 mL/kg· d 灌胃; ③濃度為 100 μg /mL MNNG 溶液裝入涂有黑漆的 避光飲水瓶內(nèi)作為飲料自由飲用，每 24 h 新鮮配制并更換 1 次，造模期間不再給予其它飲水; ④配合饑飽失常法( 2 d 飽食，1 d 禁食) ，造模 16 周結(jié)束后隨機抽取 M 組大鼠 4 只 做胃黏膜病理組織學(xué)檢查，確認(rèn)模型成功后全部停止造模 藥物。N 組每只以等量生理鹽水灌胃，清潔自來水自由飲 用，普通飼料喂養(yǎng)。參照《藥理實驗方法學(xué)》對于 任何體質(zhì)量動物的等效劑量直接折算法進行換算，在大鼠 造模的同時各給藥組即給予相應(yīng)藥物干預(yù)。X 組: 給予欣 胃顆粒凍干粉 4． 30 g /kg 灌胃給藥，每天 1 次，至模型制備 成功; W 組: 胃復(fù)春 0． 39 g /kg，灌胃給藥，每天 1 次，直至模 型制備成功。N、M 組: 給予同等體積的蒸餾水，灌胃給藥， 每天 1 次，直至模型制備成功。模型制備成功后，所有大鼠 禁食不禁水 24 h，然后全部注射麻藥后處死，處死后的大鼠 迅速剖腹取胃，沿胃大彎將其剪開，用預(yù)冷的 0． 01 mol /L PBS 進行漂洗，將漂洗干凈的胃組織平鋪于冰盤上，肉眼觀 察了解胃黏膜變化情況后，于胃竇部剪取胃組織 2 塊，液氮 處理后將其置于 － 80 ℃ 超低溫冰箱統(tǒng)一保存，之后進行 Western Blot 檢測。另在大鼠胃竇部位剪取部分胃組織，迅 速置于 4% 多聚甲醛溶液中固定，光學(xué)顯微鏡下觀察了解 胃黏膜病理形態(tài)學(xué)變化情況并進行免疫組化檢測。

3 結(jié)果

造模及藥物干預(yù)過程 M 組 大鼠抽檢 4 只，死亡 4 只; X 組大鼠死亡 3 只、W 組大鼠死 亡 3 只，N 組大鼠無死亡; 共計死亡 10 只。其中 2 只大鼠 死亡時解剖發(fā)現(xiàn)肺部的大量瘀血，因此我們認(rèn)為是灌胃不 當(dāng)所致; 有 2 只大鼠在死亡前腹脹明顯，體質(zhì)量有明顯減輕 且喜蜷縮在角落，解剖后發(fā)現(xiàn)多為腸脹氣; 有 4 只大鼠具有 明顯的喘息音，口鼻處常伴有黏液或血性的分泌物，經(jīng)解剖 后確診為肺感染; 另外有 2 只大鼠死亡原因不明。

4 討論

由于祖國醫(yī)學(xué)并沒有對應(yīng) PLGC 的病名，所以現(xiàn)代醫(yī) 家根據(jù)其相關(guān)癥狀，把 PLGC 歸于“胃痞”的范疇。導(dǎo)師謝 晶日教授經(jīng)過多年的臨床實踐和實驗研究，并根據(jù)目前的 社會特點，提出觀點: 飲食不節(jié)與情志不暢是當(dāng)下導(dǎo)致本病 的最重要的病因。同時，隨著人們生活節(jié)奏的加快，壓力驟 增，木郁克土，則易生本病。以上兩種因素隨病因不同，但 殊途同歸都是由于，脾虛日久，耗傷胃陰，氣陰兩虛，鼓動滋 養(yǎng)乏力，血行不暢、胃絡(luò)瘀血、瘀而化熱，內(nèi)生熱毒，終成氣 陰兩虛夾瘀夾毒。