近年來(lái)，眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛指出，骨髓間充質(zhì) 干 細(xì) 胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs) 在體內(nèi)特定微環(huán)境或體外特定培養(yǎng)條件下， 可以分化為心肌樣細(xì)胞，可用于心肌梗死后的 細(xì)胞移植治療，為受損心臟的細(xì)胞重建及衰竭心臟 的功能恢復(fù)提供一種全新的治療方法。1，25-維生 素 D3( 1，25-vitamin-D3 ) ，是維生素 D 的激素活性代 謝產(chǎn) 物。有 研 究 表 明，在 心 肌 細(xì) 胞 中 加 入 1，25- vitamin-D3，可以促進(jìn)心肌管的形成，且其通過(guò)負(fù)調(diào) 控經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路和上調(diào)非經(jīng)典 Wnt-11 的表達(dá) 來(lái)促進(jìn)心臟細(xì)胞的分化。

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)健康雄性 SD 大鼠，3 周齡，質(zhì)量 25 ～ 35g，由河北北方學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供( 合格證號(hào) 為: No． 11401500056665 ) ; IMDM 培 養(yǎng) 基 ( 美 國(guó) Corning 公司) ; FBS( 澳大利亞 Gibco 公司) ; 1，25- vitamin-D3( 大連美侖生物技術(shù)有限公司) ; 大鼠抗 CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM 7 抗體 ( 美 國(guó) BD 公司) ; 免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒( 北京中杉金 橋生物技術(shù)有限公司) ; 熒光素標(biāo)記的羊抗兔 IgG / FITC( 北京博奧森生物技術(shù)有限公司) ; 兔抗原肌球 蛋白( tropomyosin，TPM) 多克隆抗體、兔抗間隙連接 蛋白 43( connexin 43，Cx43) 多克隆抗體、兔抗心肌 肌鈣蛋白 T( cardiac troponin T，cTnT) 多克隆抗體 ( 美國(guó) Abcam 公司) ; 兔抗 β-actin 單克隆抗體( 武漢 愛(ài)博泰克生物科技有限公司) ; HＲP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG( H+L) ( 美國(guó) KPL 公司) ; ＲNAprep Pure 培養(yǎng)細(xì) 胞/細(xì)菌總 ＲNA 提取試劑盒; 轉(zhuǎn)錄 因 子 GATA 結(jié) 合 蛋 白 4 ( GATAbinding protein 4，GATA4) 、Nkx2. 5、GAPDH 基因引 物( 大連寶生物工程有限公司) 。

2． BMSCs 的分離培養(yǎng)

脫頸處 死 大 鼠，置 于 75% 乙 醇 中 浸 泡 5 ～ 10 min。于超凈臺(tái)中無(wú)菌條件下分離四肢長(zhǎng)骨，在含有 Pen-Strep 的 PBS 中浸洗 3 次，剪掉骨骺端，充分暴 露骨髓腔，用無(wú)血清培養(yǎng)基將骨髓沖到 15 ml 無(wú)菌 離心管中，常溫離心，棄上清，加入 5 ml 含 15% FBS 的常規(guī)培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液后接種于無(wú)菌培養(yǎng) 瓶中，放置在 37 ℃、飽和濕度、5%CO2 的細(xì)胞培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。48 h 后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁 情況，并進(jìn)行首次換液，棄除懸浮細(xì)胞，此后每 72 h 換液 1 次，待貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)到 80% ～ 90%時(shí)，用 0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳至 2 ～ 3 代時(shí)可用 于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每天倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞 貼壁、形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，并攝片。

3． BMSCs 表面抗原的鑒定

取第 3 代匯合至 80% ～ 90%的 BMSCs，棄去原 培養(yǎng)基，PBS 漂洗 1 次，0. 25%胰蛋白酶消化，常規(guī) 培養(yǎng)基終止消化后反復(fù)充分吹打，將細(xì)胞懸液移至 15 ml 無(wú)菌離心管中，常溫離心，棄上清，加入 PBS 振蕩、重懸、離心、漂洗 2 次，棄上清，剩余約 300 μl， 細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×1010 /L，均勻 分裝至 9 支 5 ml 離心管中，每管 200 μl，分別加入 CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM 7 及其同型對(duì) 照抗體，陰性對(duì)照組加入適量 PBS，混勻，4 ℃ 條件 下避光孵育 30 min，常溫離心，棄上清，加入適量 PBS 漂洗、離心，棄上清后各組加入 500 μl PBS，制 成單細(xì)胞懸液，運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

4． BMSCs 的誘導(dǎo)及繼續(xù)培養(yǎng)

第 2 代 BMSCs 培養(yǎng) 48 h 后，應(yīng)用 1，25-vitaminD3 對(duì)其進(jìn)行定向誘導(dǎo)，設(shè) 4 個(gè)濃度，分別為 3、6、12、 24 nmol /L，72 h 后更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，另 設(shè) 1 個(gè) BMSCs 未誘導(dǎo)組，整個(gè)過(guò)程只加入常規(guī)培養(yǎng) 基。倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生 長(zhǎng)狀況。封閉液孵育膜 120 min; 一抗稀釋液( β-actin，以 1 ∶ 10 000 的比例稀釋; TPM、Cx43、cTnT，均以 1 ∶ 1000 的比例稀釋) 孵育膜，4 ℃ 條件下過(guò)夜; 室溫脫色搖 床上用 TBST 洗 3 次，每次 10 min; 二抗稀釋液( 山 羊抗兔 IgG( H+L) ，以 1 ∶10 000 的比例稀釋) ，室溫 孵育膜 120 min; 室溫脫色搖床(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)上用 TBST 洗 3 次， 每次 10 min; ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，成像儀成像; 進(jìn)行 圖像分析。

5 結(jié) 果 

原代細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶初期呈圓形，在培養(yǎng)基 中呈懸浮狀態(tài)，BMSCs 在 6 ～ 8 h 后開(kāi)始貼 壁，48 h 后首次換液，細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯增加; 72 h 后貼壁細(xì)胞大部分呈短梭形，圓鈍的突起自部分細(xì) 胞向外周伸出，小部分細(xì)胞呈橢圓形及多邊形 ; 培養(yǎng) 1 周的 BMSCs，細(xì)胞進(jìn)一步伸展，體積增 大，呈現(xiàn)出多樣化的形態(tài) ; 血細(xì)胞、造血干細(xì)胞等 在 換 液、傳代的過(guò)程中被逐漸清除; 1，25- vitamin-D3 誘導(dǎo) 4 周的 BMSCs，相鄰細(xì)胞間聯(lián)系緊 密，排列具有明顯的方向性，部分細(xì)胞形成漩渦樣結(jié) 構(gòu)。不同濃度 1，25-vitamin-D3 誘導(dǎo)后的 BMSCs，其數(shù)量及形態(tài)存在差異。3 nmol /L 組、6 nmol /L 組和 12 nmol /L 組誘導(dǎo) 72 h 后，BMSCs 增殖 顯著，且細(xì)胞形態(tài)明顯改變，大部分已轉(zhuǎn)變成類(lèi)長(zhǎng)梭 形或多邊形; 24 nmol /L 組誘導(dǎo) 72 h 后，BMSCs 細(xì)胞 數(shù)量相對(duì)較少，形態(tài)變化不明顯，與未誘導(dǎo)組類(lèi)似， 隨后則逐漸轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)梭形及多邊形。