黃曲霉毒素( aflatoxins，AFs) 主要是由黃曲 霉( Aspergillus flavus) 和寄生曲霉( A． parasiticus) 等真菌產(chǎn)生的一類有毒次生代謝物，在自然界中 廣泛存在，侵染包括小麥、玉米、花生、大豆和稻米 等農(nóng)作物，對(duì)人畜有強(qiáng)烈的致病性、致癌性，不僅能夠引起急性和亞急性中毒，還能夠引起黃疸、貧 血、肝臟損傷以及胃癌、肺癌、結(jié)腸癌等，是毒性最 強(qiáng)的真菌毒素。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素共有 20 余種，根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光照射下產(chǎn)生熒 光顏色的不同，可將其分為 B 族和 G 族兩大類及其衍生物，在紫外光照射下，B 族毒素發(fā)出藍(lán)色熒 光，G 族毒素發(fā)出綠色熒光。植物來(lái)源的食物 易受到黃曲霉毒素 B1 ( AFB1 ) 、黃曲霉毒 素 B2 ( AFB2 ) 、黃曲霉毒素 G1( AFG1 ) 和黃曲霉毒素 G2 ( AFG2 ) 的污染。其中 AFB1 的毒性作用最強(qiáng)， 1993 年世界衛(wèi)生組織( World Health Organization， WHO) 的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將 AFB1 列為Ⅰ類致癌物。

1 材料與方法

1. 1 考核樣品

考核樣品由 FAO 委托 Texas A＆M 大學(xué)提供， 4 輪考核均為玉米粉樣品，要求測(cè)定其中黃曲霉 毒素 B1 含量及黃曲霉毒素總量( B1、B2、G1 和 G2 ) 。100 g 考核樣品分別稱取，每份 2 g，共稱得 樣品 50 份，進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定。正式測(cè)定前 先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

1. 2 儀器和試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜串聯(lián)三重 四極桿質(zhì)譜儀( 美國(guó) Waters 公司，Xevo TQS 型) ; 冷凍離心機(jī)( 3K15，Sigma 公司) ; 其林貝爾旋渦混合器VORTEX-5; 氮吹儀 ( N-EVAP 型，美 國(guó) Organomation 公 司) ; Waters BEH C18 色 譜 柱 ( 100 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm) ; MultiSep 226 固 相 萃 取 柱 ( 北 京 Ｒomer 公 司， 5 mL) ; Milli-Q 型純水儀( 美國(guó) Millipore 公司) ; 甲 醇、乙腈( Fisher，質(zhì)譜級(jí)) ; 甲酸、乙酸銨( 色譜級(jí)， Dikma 公 司 ) ; 氨 水 ( 色 譜 純，德 國(guó) CNW Technologies GmbH) 。 標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo): AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2 的 標(biāo) 準(zhǔn) 混 合 溶 液 ( 北 京 Ｒomer 公 司， 0. 5 μg /mL) ; 13C-黃曲霉毒素 B1( 13C-AFB1 ) 、13C黃曲霉毒素 B2 ( 13 C-AFB2 ) 、13 C-黃曲 霉 毒 素 G1 ( 13C-AFG1 ) 和13C-黃曲霉毒素 G2( 13C-AFG2 ) 的標(biāo) 準(zhǔn)混合溶液( 北京 Ｒomer 公司，0. 5 μg /mL) ，純度 ＞98%，－20 ℃儲(chǔ)存。

1. 3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取玉米粉樣品 2 g( 精確至 0. 01 g) ，轉(zhuǎn) 移至 50 mL 的離心管中，加入 100 ng /mL 同位素 內(nèi)標(biāo) 100 μL，室溫靜置 2 h，加入 10 mL 乙腈/水溶 液( 86 ∶ 14，V /V) ，室溫下翻轉(zhuǎn)混合 1 h，超聲提取 30 min，9000 r /min 離 心 15 min，取 上 清 液，待 凈化。 取上清液過(guò) MultiSep 226 凈化柱，收集流出 液。準(zhǔn)確吸取 5 mL 流出液，在 40 ℃水浴下，氮吹 近干，用 1 mL 初始流動(dòng)相復(fù)溶后，超高速 18000 r /min 下離心 15 min，取上清液于進(jìn)樣小瓶中，待 上機(jī)檢測(cè)。

1. 4 儀器條件

1. 4. 1 液相色譜條件

采用 Waters BEH C18色 譜柱( 100 mm×2. 1 mm，1. 7 μm) ; 柱溫 40 ℃ ; 進(jìn)樣 量 5 μL; 流速 0. 35 mL /min; 流動(dòng)相 A 為 0. 1%甲 酸水溶液，流動(dòng)相 B 為甲醇，梯度洗脫: 0 ～ 1. 0 min，5% ～ 32% B; 1. 0 ～ 5. 0 min，32% ～ 35% B; 5. 0 ～ 8. 0 min，35% ～ 42% B; 8. 0 ～ 9. 0 min，42% ～ 90% B; 9. 0 ～ 10. 0 min，90% B; 10. 0 ～ 10. 1 min， 90% ～ 5% B; 10. 1 ～ 13. 0 min，5% B。

1. 4. 2 質(zhì)譜條件

電離模式采用電噴霧正離子 化模式( ESI+ ) ，離子源溫度 150 ℃，毛細(xì)管電壓 3. 0 kV，脫溶劑氣溫度 500 ℃，脫溶劑氣流速 800 L / h，錐 孔 氣 流 速 150 L / h，碰 撞 氣 流 速 0. 2 mL /min; 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)( MＲM) 模式掃描。

1. 5 比對(duì)結(jié)果評(píng)價(jià)方法

采用 Z 評(píng)分進(jìn)行結(jié)果評(píng)價(jià)。Z 評(píng)分是 由能力驗(yàn)證的指定值( 或均值) 和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 偏差計(jì)算的實(shí)驗(yàn)室偏倚的標(biāo)準(zhǔn)化度量，按照以下 準(zhǔn)則對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定: ∣ Z ∣≤2 表示結(jié)果 “滿意”，即產(chǎn)生“理想結(jié)果”的情況超過(guò) 95%; 2＜ ∣ Z ∣＜3 表示結(jié)果“有問(wèn)題或可疑結(jié)果”，即產(chǎn) 生“理想結(jié)果”的情況約等于 5%，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)認(rèn)真 檢查結(jié)果偏差較大的原因; ∣ Z ∣≥3 表示結(jié)果 “異常值或離群結(jié)果”，即產(chǎn)生“理想結(jié)果”的情況 大約僅有 0. 1%。

2 結(jié)果

樣品中黃曲霉毒素 B1 及其總量的含量與樣 品的取樣范圍有關(guān)，考核中 2 g 為 1 份子樣品，表1 為比對(duì)考核中樣本中黃曲霉毒素含量的分布 情況。

4 輪次的考核中，組織者要求進(jìn)行黃曲霉毒 素 B1 和黃曲霉毒素總量( Total AFs) 的測(cè)定。由 組織者提供的分析報(bào)告顯示，每輪次中全球約 100 個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加比對(duì)考核，包括國(guó)家實(shí)驗(yàn)室、區(qū) 域?qū)嶒?yàn)室及商業(yè)實(shí)驗(yàn)室等，采用的方法有快速檢 測(cè)法，高效液相色譜法及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 法，參加比對(duì)考核的實(shí)驗(yàn)室提供了 AFB1 和/或黃曲霉毒素總量的結(jié)果。

3 討論

在對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)室總 結(jié)了一些實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)。包括黃曲霉毒素在內(nèi)的真菌毒素在樣品中的 分布是不均勻的，因此在分析過(guò)程中取樣的代表 性非常重要，往往影響含量的測(cè)定結(jié)果。2016 年 本實(shí)驗(yàn)室首次參加考核，實(shí)驗(yàn)室將發(fā)放的 100 g 考核樣品分別稱取，每份 2 g，共稱得樣品 50 份， 采用考核的測(cè)定方法進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定，結(jié)果 顯示，不同的取樣范圍決定了樣品中 AFB1 及其 總量的含量分布。表 1 給出了 2016 年第 2 輪次 的樣品取樣量與含量分布情況。同樣，在 2017 年 2 個(gè)輪次的考核中，樣品的取樣份數(shù)影響著 AFB1 及其總量的含量分布。為增加測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行樣品的檢測(cè)時(shí)應(yīng)做到對(duì)全部的考核樣品進(jìn)行測(cè)定。



 

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